結(jié)晶紫法活性測(cè)定

　　1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞，用0.25%胰酶(以無(wú)鈣鎂離子PBS溶液配制，pH7.4)消化后，加進(jìn)RPMI-1640培養(yǎng)基(10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH7.2)奏樂(lè)細(xì)胞，使形成細(xì)胞懸液。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞數(shù)為2~2.5×105個(gè)/ml。接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔。接種細(xì)胞時(shí)須不斷搖動(dòng)細(xì)胞懸液，以保證各孔細(xì)胞數(shù)的均勻一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，觀察到孔中細(xì)胞長(zhǎng)滿70~80%。

　　2、在上述RPMI-1640完全培養(yǎng)基中加進(jìn)放線菌素D，使終濃度為1.5μg/ml，配成樣品稀釋液。取此稀釋液900μl至Eppendorf管中，另在9個(gè)5ml管中加進(jìn)700μl稀釋液。

　　3、用完全培養(yǎng)基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品(上海恰爾生物技術(shù)有限公司研制，批號(hào)：0304，凍干粉劑，蛋白濃度：2mg/支)復(fù)溶至1000μl(液體樣品測(cè)定蛋白濃度后，直接進(jìn)行下一步操縱)，取出100μl至已裝有900μl稀釋液的Eppendorf管中，充分混勻，盡量不起泡沫。再?gòu)拇斯苤形��?00μl至下一管中，如此反復(fù)n次(即測(cè)定前10倍稀釋若干次，直到與估計(jì)活性相接近時(shí))。

　　4、從最后稀釋的Eppendorf管中吸出700μl樣品至已裝有700μl稀釋液的5ml管中，充分混勻。再?gòu)拇斯苤形��?00μl至下一管同樣裝有700μl稀釋液的5ml管中，如此反復(fù)9次(即測(cè)定時(shí)倍比稀釋樣品)。

　　5、棄往96孔板中舊的培養(yǎng)基，從第一個(gè)5ml管中吸取已稀釋的樣品100μl至第2排細(xì)胞孔中，每個(gè)稀釋度作6復(fù)孔(n=6);從第二個(gè)5ml管中吸取的樣品加進(jìn)第3排細(xì)胞中，依此類推，直至第10排孔結(jié)束。第1排中不含細(xì)胞，加進(jìn)100μl/孔含有放線菌素D的稀釋液作空缺對(duì)照;第11排加100μl/孔稀釋液作細(xì)胞對(duì)照;第12排加不含放線菌素D的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。

　　6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，初步判定結(jié)果。

　　7、棄除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加進(jìn)100μl染色液(1.5mmol/L結(jié)晶紫)染色30min。洗往染色液，甩往水分并在吸水紙上拍打以使干燥。沖洗程度以在吸水紙上拍打時(shí)，沒(méi)有顏色出現(xiàn)為宜。

　　8、充分干燥后，每孔加進(jìn)100μl33%濃度的冰醋酸，在振蕩儀上充分振蕩使結(jié)晶溶解。設(shè)定λ=595nm酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光值，據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算出對(duì)細(xì)胞50%殺傷時(shí)所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。

　　[活性計(jì)算]

　　活性單位定義：在上述測(cè)定條件下，以50%SW1990腫瘤細(xì)胞被殺傷時(shí)，為基因工程人腫瘤凋亡素的1個(gè)活性單位。

　　1、樣品的稀釋度取常用對(duì)數(shù)。

　　2、根據(jù)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞毒活性(光密度值)與稀釋度的對(duì)數(shù)，進(jìn)行線性回回，得到計(jì)算公式y(tǒng)=ax b，分析相關(guān)系數(shù)R值，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求者進(jìn)行下一步分析。

　　3、代進(jìn)50%殺傷時(shí)的光密度值(即第11排細(xì)胞光密度值的一半)，計(jì)算出稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)，再求出稀釋倍數(shù)。

　　4、根據(jù)原樣品濃度及稀釋倍數(shù)計(jì)算出基因工程人腫瘤凋亡素對(duì)細(xì)胞50%殺傷時(shí)的濃度，再算出比活性。

　　5、其他細(xì)胞的檢測(cè)方法同上，計(jì)算時(shí)根據(jù)對(duì)SW1990標(biāo)定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單位，先求出對(duì)細(xì)胞50%殺傷時(shí)的所需活性單位，再根據(jù)基因工程人腫瘤凋亡素對(duì)SW1990細(xì)胞殺傷的比活性算出相應(yīng)的盡對(duì)量。

　　[計(jì)算結(jié)果]

　　0304批原液：比活為：1.03×107活性單位/mg

　　蛋白的生物活性及結(jié)構(gòu)測(cè)定方法

　　生物活性測(cè)定[37,38]是將人胰腺癌1990細(xì)胞以2×105個(gè)/ml種進(jìn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6小時(shí)，用完全培養(yǎng)液(加有1.2μg/m的放線菌素D)做梯度稀釋的樣品加進(jìn)細(xì)胞板(n=3)。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱，18h后棄上清，以結(jié)晶紫固定液(結(jié)晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%)染色15min，蒸餾水洗往結(jié)晶紫。每孔再加進(jìn)200μ33%的乙酸，旋渦混勻，置酶聯(lián)儀讀出D(595)值，以未加細(xì)胞的空缺孔為D本底。根據(jù)活性單位定義：使培養(yǎng)孔中的細(xì)胞50%死亡為一個(gè)單位。

　　MTT法——活性測(cè)定

　　1、接種細(xì)胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103-104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。

　　2、培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移進(jìn)CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)3-5天。(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵��?

　　3、呈色：培養(yǎng)第3-5天后，每孔加進(jìn)MTT溶液(5mg/mL)20μl，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清。每孔加進(jìn)150μlDMSO(二甲基亞砜)，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。

　　4、比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定個(gè)孔吸收值，記錄結(jié)果。