一、引言

　　在八十年代以前，生物大分子(特別是核酸、蛋白)用離心方法分離純化占有很重要的地位。用分析超離心方法測定生物大分子的分子量、沉降系數(shù)、擴散系數(shù)、微分比容等在生物化學(xué)實驗中也占有一席之地。八十年代以后，由于離心技術(shù)的快速發(fā)展(微處理器的引入，變頻驅(qū)動的完善、轉(zhuǎn)速的提高等等)，先進的制備用超速離心機已經(jīng)能夠替代昂貴的分析機型完成M.S.D 等參數(shù)的測定。分析超速離心機在實驗離心技術(shù)領(lǐng)域轉(zhuǎn)向與其他實驗技術(shù)(如NMR，x 衍射等)結(jié)合研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能。

　　進入九十年代，電泳技術(shù)的發(fā)展使得原來用離心技術(shù)來測定生物大分子分子量的方法又變得落后了。用電泳技術(shù)測定分子量M.方法簡單、快速、成本較低(文獻2， 3)。而近年來用核酸與蛋白的快速測序方法來測定生物大分子的一些參數(shù)，比用離心法、電泳法更先進，精度更高。(文獻4，5)

　　盡管如此，離心分離方法還是以它的部分優(yōu)勢存在著：分離范圍廣，容量大;可以研究天然生物大分子的流體動力學(xué)特性;可以在電離介質(zhì)中進行生物大分子的片段分離;對緩沖劑限制很小(在電泳技術(shù)中由于電流的熱效應(yīng)而限制了緩沖劑的使用)等等。另外在各種實驗方法的前處理階段，離心法還是被廣泛的使用著�？紤]到各個研究部門的設(shè)備分布情況，在很多條件下，離心分離的使用還具有相當(dāng)?shù)膹V泛性。作為有效的分離純化方法，差分離心、速率區(qū)帶密度梯度離心和等密度離心在生物大分子的研究中還占有重要地位(文獻1)。

　　二、生物大分子的離心分離要點：

　　(1) 防止污染：

　　要避免在實驗過程中由于生物大分子部分受損而引起降解或變性，引起降解的原因很多，如實驗過程中的外力作用;某些酶污染等等，但最常見的原因是酶的作用。

　　實驗過程中由于污染某些脫氫酶進入樣品而使生物大分子變性。

　　避免的方法：

　　(i)用抑制劑來降低脫氫酶的作用：常用的抑制劑有DFD(二異丙基磷酸氟)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、EDTA(1~10mM )、SDS(0.1~1% )、DEPC(焦碳酸二丁酯)(0.1%)……。

　　(ii)對所有接觸樣品的容器(離心管、管蓋組件、移液器、移液管等等)進行徹底消毒(蒸汽消毒或0.1%DEPC 侵泡)。

　　(iii )由于實驗人員皮膚表面有酶存在，所有實驗必須使用經(jīng)過消毒的手套操作。

　　(iv)合適的PH 值：過度的酸堿度也會使生物大分子降解。

　　(2) 避免變性的其他注意事項：

　　(i)轉(zhuǎn)頭在離心前預(yù)冷到接近離心溫度(在冰箱中放置過夜，或在恒溫箱中保溫)。對于超速離心機，其制冷系統(tǒng)主要用于抵消轉(zhuǎn)頭在稀薄空氣中高速運轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)頭表面線速度從亞因速—>超因速)時氣動力摩擦產(chǎn)生的熱量。在真空中，只有輻射傳熱的情況下，高速運轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)頭溫度從室溫(如夏天30~35℃)降到5℃時間很長(如1 小時左右)一般應(yīng)預(yù)冷到接近離心溫度(±2℃)以確保在離心的最初階段(15 分鐘以內(nèi))轉(zhuǎn)頭溫度和樣品溫度一致。

　　(ii)用固定角式或近垂直管轉(zhuǎn)頭或垂直管轉(zhuǎn)頭作梯度離心時必須利用離心機的慢加速(0~500rpm )、慢減速(500rpm~0)功能，以保證梯度方向的順利轉(zhuǎn)換。

　　(iii)離心開始、離心結(jié)束都要小心地輕放和輕取離心管，避免大的震動。

　　(iv)卸樣過程應(yīng)在無震動的實驗臺上進行，環(huán)境溫度和離心溫度相近，卸樣方法應(yīng)選擇平穩(wěn)、外力作用很小的方式，盡可能不用泵輸送樣品。

　　(3) 有關(guān)梯度離心的其他要點：請參照文獻(8)(9)，本文略。

　　(三)生物大分子的離心分離實例：

　　例(1)去蛋白的RNA 分離：

　　(i) 樣品勻漿加入9 倍容積的冰冷20mM Tris-HCl( PH8.0 ) 1mMEDTA 。

　　(ii) 加入1/10 容積的10% SDS，再加入等容積的(苯酚：氯仿：異丙醇)(容積比50：50：2)溶液并含有0.1% 的8-羥基喹啉溶液充分混合使其乳化。

　　(iii) 以上溶液在10,000xg 離心10 分鐘。

　　(iv) 移出上清液，重復(fù)(ii)(iii)過程一次。

　　(v) 第二次離心后上清液中加入1/10 容積的3M 醋酸銨，充分混合后再加入二倍容積的乙醇，并在-20℃靜置二小時以上。

　　(vi) 10,000xg 5℃離心10 分鐘得到RNA 沉淀。

　　(vii) 用干燥的N2 氣體蒸發(fā)掉沉淀中殘留的乙醇。

　　(viii) 將RNA 溶于20mMTris-HCl(PH8.0)，1mMEDTA 中，-20℃低溫保存待用。

　　例(2)從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA：

　　(i) 溶液制備：

　　溶液I：50mM 葡萄糖，10mM(EDTA)，25mM Tris-HCl(PH8.0)

　　溶液II：0.2M NaOH，1% SDS

　　溶液III：3M 醋酸納(PH4.8)

　　TE 緩沖液：10mMTris-HCl(PH7.4)，2mM EDTA

　　(ii)E. Coli 培養(yǎng)液1 升(量大按比例配置)

　　(iii)將1 升培養(yǎng)液在4,000rpm(約2,000xg)，5℃離心20 分鐘，得到細菌沉淀。

　　(iv)用100ml 冰冷的溶液I“洗”沉淀，再次離心，4,000rpm，5℃， 20 分。

　　(v)用20ml 冰冷溶液I 將第二次離心沉淀調(diào)成均勻懸浮液。

　　(vi)每ml 懸浮液加入2mg 溶菌酶，并在0℃冰浴中放置10 分鐘。

　　(vii)加入40ml 溶液II，輕輕攪拌后，在冰浴中放置5 分鐘。

　　(viii)加入30ml 溶液III，在冰浴中放置20 分鐘，使蛋白質(zhì)大部分沉降。

　　(ix)在高速冷凍離心機上用角式轉(zhuǎn)頭，10,000rpm(約10,000xg )離心15 分鐘，5℃。

　　(x)小心地倒去上清(不擾動沉淀)，在沉淀中加入55ml 異丙醇， 即得到粗制的質(zhì)粒DNA 溶液。

　　(xi)粗制DNA 液在-20℃靜置15 分鐘以上，再在12,000rpm(約15,000xg)4℃離心5 分鐘，倒去上清液。

　　(xii)真空中抽去異丙醇，沉淀中加入18ml 經(jīng)過消毒的TE 緩沖液， 在沉淀溶解后再加入0.65ml，1% E.B.

　　(xiii )以上溶液每ml 加入分析純CsCl 1 克，使其完全溶解，檢測溶液折射率應(yīng)為1.3890(密度≈1.587)

　　(xiv )用以上溶液按照參考文獻(6)所介紹的方法作質(zhì)粒DNA 分離。

　　(xv)離心后在300nm 紫外光下可顯示DNA 帶(線性DNA 帶和質(zhì)粒DNA 帶，RNA 沉淀在底部，蛋白質(zhì)浮在液面)。

　　(xvi)用文獻(1)介紹的方法取出質(zhì)粒DNA，抽提去掉E.B. 透析法或脫鹽柱去除CsCl 。

　　例(3)用CsCl 梯度分離DNA 并測定其組成(% G+C)

　　(i)CsCl 溶液密度D 與溶液中CsCl 的重量百分比濃度P 之間的關(guān)系： D=138.11/(137.48-P)

　　(ii) 制備初密度為1.706 克/毫升的梯度液，應(yīng)按以下要求配置

　　·4.85 克CsCl (分析純)

　　·50μl ，1.0M Tris-HCl(PH7.4)

　　·20μl， 0.2M EDTA(PH7.4)

　　·0.5ml DNA 樣品

　　·3.3ml 重蒸水

　　(iii) 用光折射儀檢測CsCl 的初始密度D，設(shè)測得的光折射率為RI，則有 D=10.8601×RI-13.4974

　　(iv) 測得的RI 應(yīng)為1.4000，如果檢測值大于此值，再加重蒸水容量為V(毫升)，梯度液的總?cè)萘繛镚(毫升) V=1.52×G×(D 測定-D 需要) 如果檢測值小于1.4000，那么再加固態(tài)CsCl(W)克W=1.32×G×(D 需要-D 測定)

　　(v) 再測溶液折射率直至調(diào)整RI=1.4000

　　(vi) 將配置好的液體充滿于5ml 的一次性快速密封離心管，并利用封口機密封。

　　(vii) 固定角式轉(zhuǎn)頭150,000xg ， 20 ℃離心50~55 小時(約35,000rpm)或垂直管轉(zhuǎn)頭300,000xg，20℃離心12 小時(約55,000rpm )

　　(viii) 離心后利用梯度儀或手工收集成50 管(每管100μl)。

　　(ix) 對每管樣品測定折射率至小數(shù)4 位，測試過程中應(yīng)保持樣品溫度為20℃，根據(jù)折射率RI 計算各管樣品的密度D。

　　(x) 每管中加1 毫升重蒸水，在260nm 波長時分別測各管光密度(OD)，如果DNA 已做了同位素標記，那么還要對收集的樣品分別做液體閃爍計數(shù)儀測定輻射值。

　　(xi) 以離心管容量為橫坐標(從管底至管面)，分別以各管測得的OD 值或同位素放射計數(shù)值為縱坐標作曲線。找到曲線的峰值位置即可做DNA 定位。

　　(xii) 用下式計算DNA 組成：

　　%(G+C)=(D-1.66)/0.098×100 如果能在離心樣品中加入標準DNA，計算就更加準確。

　　說明：

　　·進入90 年年代以后用DNA 測序法或在260nm 波長加溫溶點法進行測定比離心法更簡單，究竟用什么方法要由使用單位現(xiàn)有設(shè)備來決定。

　　·在不用E.B.(溴乙錠)的情況下，用CsCl 梯度分離DNA 一般不會影響DNA 的構(gòu)型。

　　·某些梯度材料如Cs2SO4 在離心過程中形成的密度梯度太陡而不適合做質(zhì)粒DNA 離心。

　　·某些非電離性的梯度材料(如Nycodenz )也不適用于此類離心。

　　例(4)用CsCl 梯度純化RNA

　　·配置溶液：

　　I：7.5M 氯胍，50mM 醋酸納(PH7.0)

　　0.1M 2-巰基乙醇，0.5% Sarkosyl 。

　　II：10mMTris-HCl(PH7.4)，2Mm EDTA 。

　　·實驗步驟:

　　(i) 在溶液I 中制備細胞勻漿,每克細胞加入10ml I 溶液.

　　(ii) 勻漿離心, 8,000rpm(約8,000xg),5℃,10 分鐘,固定角式轉(zhuǎn)頭,PA 或PP 離心管。離心后倒出上清液備用。

　　(iii)用容量為13-14ml，最高轉(zhuǎn)速在40,000-41,000rpm 的甩平轉(zhuǎn)頭，鈦合金吊桶，PA 離心管，每管下部鋪設(shè)2ml，5.7M CsCl(在溶液II 中)，上部為(ii)離心后的上清液。離心轉(zhuǎn)速31,500rpm(約185,000xg)，10℃離心18 小時，或用固定角式轉(zhuǎn)頭，每管下部鋪設(shè)3ml，5.7M CsCl (在II 中)，上層的(ii)離心后的上清液， 65,000rpm(約410,000xg)，10℃，離心2 小時(慢加速，慢減速)。

　　(iv)離心后，小心地倒去上層蛋白質(zhì)，中層的DNA，已經(jīng)初步純化的RNA 沉淀在離心管底部。

　　(v)沉淀中加入0.5ml 溶液I 并移入1.5ml eppendorf 管，再在微量離心管中加入0.5ml 溶液I，搖勻。

　　(vi)在離心管中加50μl，1M 醋酸(在500μl 乙醇中)。

　　(vii)離心管置于低溫冰箱中-20℃靜置1 小時以上。

　　(viii)臺式離心機12,000rpm(約11,000xg)離心10 分鐘。倒去上清液，沉淀為RNA (進一步純化的)。

　　(ix)沉淀溶于400 μl 溶液II 并假如40μl 3M 醋酸納(PH5.0)(在880μl 乙醇中)。

　　(x)-20℃靜置過夜。

　　(xi)第二天，用高速臺式離心機12,000rpm(約11,000xg)離心10 分鐘，倒去上清液， 沉淀用70%乙醇洗二次。

　　(xii)將RNA 溶于II，用凝膠電泳檢測(用薄層掃描儀或凝膠電泳分析儀分析結(jié)果)RNA 構(gòu)型，用分光光度計(1 毫克/毫升RNA 在260nm 時光密度為25)測定RNA 濃度。

　　(xiii)將已知構(gòu)型及濃度的RNA 在-20℃儲存。

　　例(5)：用KI 梯度分離RNA 片斷。

　　(i)將DNA 樣品溶于15mM 檸檬酸鈉，10mM 亞硫酸鈉，5mML 磷酸鈉(PH7.0)中，最終濃度不超過50μg/ml。

　　(ii) 每毫升RNA 溶液加入1.0 克KI，充分溶解后用折射儀測定RI=1.4290，如過高，過低必須修正到比值。

　　(iii) 將以上溶液充滿12ml，PA 快速密封離心管，密封后置于固定角式轉(zhuǎn)頭中，150,000xg，20℃離心60 分鐘。

　　(iv) 分部收集離心管中梯度液(30-50 管)，可用RNA 試劑定位，如果RNA 已做同位素標記，可用液閃儀定位。如果用后一種方法，在分部收集管每管中加一滴(25 μl 左右)巰基乙醇以避免在液閃儀液體中產(chǎn)生自由離子。

　　(v) 用此法可以分離單股與雙股RNA。

　　例(6)用Cs2SO4 及尿素作梯度材料分離生物大分子

　　樣品：初步離心后的蛋白-核酸混合液梯度液：

　　3.00g Cs2SO4

　　2.5ml 8M 尿素(經(jīng)過混合床去離子處理的)

　　50μl 1.0M Tris-HCl(PH7.4)

　　25μl 0.2M EDTA(PH7.4)

　　1.25ml 樣品的水溶液

　　以上各項充分混合后注入5ml PA 快速密封管

　　固定角式轉(zhuǎn)頭 130,000xg，5℃ 離心64 小時，慢減速

　　或600,000xg，5℃ 離心14 小時，慢減速

　　甩平轉(zhuǎn)頭 400,000xg，5℃ 離心22 小時

　　·結(jié)果分析：其中蛋白用35S 同位素標記

　　RNA，DNA 用32P 同位素標記

　　離心后樣品分布收集成30 管，在液閃儀上測定，繪出從離心管表面—>管底的容量為橫坐標，同位素32P， 35S 計數(shù)為縱坐標的曲線圖，很明顯可以找到蛋白，DNA，RNA 的峰位置。

　　例(7)用RbCl 梯度分離不同密度的蛋白質(zhì)：

　　配置：樣品：經(jīng)過初步分離的蛋白質(zhì) 50μg-200μg

　　1.75g RbCl

　　0.5ml 1M Tris-acetate (PH7.1)

　　水容量=3.25ml

　　(充分混合后注入離心管)

　　固定角式轉(zhuǎn)頭，5ml PA 管

　　250,000xg，5℃ 65 小時，慢減速

　　或 600,000xg，5℃ 27 小時，慢減速

　　甩平轉(zhuǎn)頭 400,000xg，5℃ 42 小時

　　離心后沿離心管長度方向分部收集成50 管。

　　用分光光度計分別測各管O.D.值，以管容量為橫坐標，O.D.值為縱坐標繪制曲線， 可以找到各種蛋白的峰位置。

　　例(8)用CsCl-Cs2SO4 梯度分離RNA 片斷：

　　配置：

　　1.9ml 飽和的CsCl 液

　　1.7ml 飽和的Cs2SO4 液

　　1.5ml RNA樣品(5-10μg 溶于0.1M Tris-HCl(PH7.5)及10mM EDTA)

　　0.25ml DMSO(5%)

　　充分混合后注入5ml PA 離心管

　　離心二次： 第一次170,000xg，25℃， 18 小時(固定角式轉(zhuǎn)頭)

　　第二次100,000xg， 25℃， 48 小時(固定角式轉(zhuǎn)頭)離心后沿離心管長度方向收集30-50 管，用比重計測密度。

　　(因為是CsCl 與Cs2SO4 混合梯度，不能用光折射儀測RI)。

　　結(jié)果：橫坐標為管容量，縱坐標為密度繪制曲線，可以找到不同密度RNA 所在位置。

　　例(9)用NaBr 梯度分離血清脂蛋白：

　　(i) 溶液配置：

　　干燥的NaBr 晶體，在210℃恒溫箱中過夜，分別配置下列不同密度的NaBr 液體：

　　1.006克/毫升(9 克/升)

　　1.019克/毫升(27 克/升)

　　1.063克/毫升(95 克/升)

　　1.210克/毫升(283.4 克/升)

　　1.386克/毫升(524.8 克/升)

　　所有的溶液均含0.05% EDTA(PH7.0)，溶液經(jīng)過濾后儲存在暗褐色瓶中，4℃保存。

　　(ii) 實驗過程

　　(1) 人全血1,000xg 離心10 分鐘去除各種血細胞，上清液為血清。

　　(2) 0.2ml 血清與0.8ml，1.386 克/毫升的NaBr 液混合。

　　(3) 將已稀釋的血清樣品1ml 置于14mlPA 管底部，然后往上依次鋪設(shè)梯度液

　　3.2ml,1.21g/ml NaBr 液

　　3.8ml,1.063g/ml NaBr 液

　　3.3ml,1.016g/ml NaBr 液

　　1.2ml,1.006g/ml NaBr 液

　　(4)甩平轉(zhuǎn)頭，260,000xg，14℃，24 小時

　　各種密度的脂蛋白從管底浮向它們自己的等密度區(qū)形成了純的各種密度脂蛋白區(qū)帶。而離心管底部保留著各種血清蛋白。

　　(5) 用上排法從離心管中抽出各層液體，由蠕動泵輸送經(jīng)過帶流動池的紫外­可見分光光度計經(jīng)檢測光密度(O.D.)值后用部分收集器收集于0.5ml eppendorf 管中。

　　(6) 從分光光度計的O.D.曲線，可以從0.5ml 離心管中給各種不同密度血清脂蛋白定位。