操作步驟

熒光定量PCR 實驗步驟:

折疊樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

折疊RNA質(zhì)量檢測

1)紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。

折疊樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

序號	反應(yīng)物	劑量
1	逆轉(zhuǎn)錄buffer	2μl
2	上游引物	0.2μl
3	下游引物	0.2μl
4	dNTP	0.1μl
5	逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV	0.5μl
6	DEPC水	5μl
7	RNA模版	2μl
8	總體積	10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

折疊樣品

管家基因(β-actin)實時定量PCR

①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為10，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為10，依次稀釋至10、10、10、10、10、10，以備用。

②反應(yīng)體系如下:

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號	反應(yīng)物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10μl
2	陽性模板上游引物F	0.5μl
3	陽性模板下游引物R	0.5μl
4	dNTP	0.5μl
5	Taq酶	1μl
6	陽性模板DNA	5μl
7	ddH2O	32.5μl
8	總體積	50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系:

序號	反應(yīng)物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10μl
2	內(nèi)參照上游引物F	0.5μl
3	內(nèi)參照下游引物R	0.5μl
4	dNTP	0.5μl
5	Taq酶	1μl
6	待測樣品cDNA	5μl
7	ddH2O	32.5μl
8	總體積	50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為:93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。

折疊模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系:

序號	反應(yīng)物	劑量
1	10×PCR緩沖液	2.5 ul
2	MgCl2溶液	1.5 ul
3	上游引物F	0.5 ul
4	下游引物R	0.5 ul
5	dNTP混合液	3 ul
6	Taq聚合酶	1 ul
7	cDNA	1 ul
8	加水至總體積為	25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×10，依次稀釋至10、10、10、10、10、10幾個濃度梯度。

折疊PCR

①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下:

序號	反應(yīng)物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10 ul
2	上游引物	1ul
3	下游引物	1ul
4	dNTP	1ul
5	Taq聚合酶	2ul
6	待測樣品cDNA	5ul
7	ddH2O	30ul
8	總體積	50 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

折疊引物列表

引物設(shè)計軟件:Primer Premier 5.0，并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。

折疊電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。